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    公开号:WO1992014846A1
    申请号:PCT/JP1992/000196
    申请日:1992-02-24
    公开日:1992-09-03
    发明作者:Toshiya Matsumoto；Takashi Kurimura；Hiroshi Kita
    申请人:Iatron Laboratories, Inc.；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 単純へルぺスゥィルスの型特異的検出方法 技術分野
    [0003] 本発明は、 ヒト単純へルぺスウィルス I型（以下、 HSV I と称することがある）及びヒト単純へルぺスウィルス II型（以 下、 HSVIIと称することがある）の型特異的検出方法に鬨す る。 背景技術
    [0004] ヒト単純ヘルべスウィルス （HSV)はヒトの知覚神経節に 潜伏し、 一度感染すると回帰発症を繰り返す。 HSVには I型 と II型とがあり、 型によって回帰発症率や薬剤惑受性が異なる ので、 HSVの型判別は重要な問題である， HSV感染症の最 も確実な診断方法はウィルスを分離して判定するものであるが、 この方法は培養細胞の準備が必要であり、 また判定まで数日を 必要とするので、 治療に適切に反映させることが困難である。 蛍光抗体法により判定する方法もあるが、 この場合には患部細 胞を必要とする。 また、 113¥を型特異的に識別する0 断 片をプローブとして患者検体をドットブロット法で検査する方 法が知られているが、 多量の試料（例えば、 200〜500 1) を必要とするだけでなく、 HSVであることは分っても、 型の判別まではできない場合があった。 従って、 短時間に、 精 度高く H S V I型と II型の型を判別することのできる手法と体 外診断薬の開発が望まれていた。
    [0005] 一方、 従来から H S Vには型特異的な識別を可能にする塩基 S列は存在しないと言われてきたのに対し、 本発明者らは H S Vの型特異的 DN Aプローブを既に開発している。 即ち、 HS V I 型又は H S VII型の D N Aを特定の制限酵素によって切断 して得られる DNA断片〔又は、 その DNA断片を適当なべク ター（プラスミド） に揷入し、 クローン化して得られる DNA を特定の制限酵素で切断して得られる DN A断片〕を標識化し、 型特異的な DNAプローブを得ることができる。 これらの標識 化 DN A断片は数百〜数キロ bp (塩基対） の大きさであり、 型別の特異性が優れている。 これらの詳細は、 特開平 2— 14 2499号公報及び特願平 2 -901 8号明細書に開示した。 しかしながら、 前記の標識化 D N A断片は化学合成によって 作成するのが困難な大きさであるので、 本発明者は、 より簡便 に取り扱うことができ （例えば、 化学合成が可能な程度の大き さであり） 、 しかも型別の特異性が減少しない塩基配列を見出 すことを目的として更に検討を続けた結果、 型特異的な識別が 可能で、 比較的小さい塩基配列を見出すことに成功した。即ち、 本発明の目的は、 HSVI 型 DNA又は HS VII型 DNAに特 異的な DN A断片の増幅に用いることのできる各種プライマー、 及び HSV I 型 DNA又は HSVII型 DNAに特異的なプロ一 ブを提供するものである。 発明の開示
    [0006] 従って、 本発明は、 式（ 1 a) ：
    [0007] CACGGGTATA AGGAC ATCCA ( l a) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有する第 1の DN Aプライマー [以下、 プライマー ( l a ) と称することがある] と、 式（2 a ) ：
    [0008] GGGTCCTCGT CCAGATCGCT ( 2 a ) で表される塩基配列の少なくとも 1 5塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有する第 2の DNAプライマー [以下、 プライマー ( 2 a ) と称することがある] との組み合わせ、 あるいは式 ( l b ) ：
    [0009] GCCTCTTTTC CCCCGGGGAG ( l b ) で表される塩基配列の少なくとも 1 5塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有する第 1の DNAプライマー [以下、 プライマー ( l b ) と称することがある] と、 式（2 b ) ：
    [0010] GGGAAAAAAG CCGCGCCGGGG ( 2 b ) 表される塩基配列の少なくとも 1 5塩基のォリゴヌクレオチド 部分を含有する第 2の DNAプライマー [以下、 プライマー ( 2 b ) と称することがある] との組み合わせと、 DNAボリ メラーゼと、 水性液体被検試料とを含む混合液を DN A増幅ェ 程にかけ、 続いて、 得られた反応液を DNA検査工程にかける こと特徴とする、 単純ヘルべスウィルスの型特異的検出方法に 鬨する。 本明細書の塩基配列において、 Aはアデニン残基、 C はシトシン残基、 Gはグァニン残基、 そして Tはチミン残基の 意味である， 図面の簡単な説明
    [0011] 第 1図は、 本発明の H SV I 型用プライマーを用いた PC R 反応により増幅された DNAに関する電気泳動の結果を示す。 第 2図は、 本発明 H S VII型型用プライマーを用いた PC R 反応により増幅された D N Aに鬨する電気泳動の結果を示す。 第 3図は、 第 2図の電気泳動像を、 放射性同位元素で標識し たプローブを用いたサザンハイプリッド法により確認した結果 を示す。
    [0012] 第 4図は、 放射性同位元素で標識した本発明のプローブを用 いて、 i n s i tuハイブリダィゼーシヨンを実施した拮果 を示す。 発明を実旌するための最良の形態
    [0013] 本発明方法で用いる液体被検試料は、 HSVを含有している 疑いのある試料であれば特に制限されない。 例えば、 患者水泡 内溶液、 《頭拭い液、 髄液等を用いることができる。
    [0014] 本発明による前記の HSV検出方法は、 主に、 （ 1 ) DNA 増幅工程と、 （2) DNA検査工程とからなる。 この DNA増 幅工程（ 1 )では、 PCR ( Polymerase chain reaction )法を用 いることができる， PCR法を利用すると、微量の DN Aから、 目的とする D N A領域のみを自動的に約 100万倍にまで増幅 することができる （Science 239:487-491,1988) 。 PCR法では、 増幅させる DN A領域を挟んで +鎖に対するプライマー （以下、 第 1プライマーと称する）及び一鎖に対するプライマー（以下、 第 2プライマーと称する）の 2種の DNAプライマーを用いる。 本発明の DNA増幅工程（ 1 ) で用いる第 1のプライマーと 第 2のプライマーとの組合せとしては、
    [0015] (a〉第 1プライマー（ la) と第 2プライマー（2a)及び、 (b)第 1プライマー（ 1 b) と第 2プライマー （2b) 、 の 2種の組合せがあり、 これらの組合せのいずれか 1種を単独 で用いるか、 又は 2種を同時に用いることができる。 前記プラ イマ一の組合せ（ a) を用いると HSV I 型の特異的検出を、 そして前記のプライマーの組合せ（b ) を用いると HS VII型 の特異的検出を行うことができる。
    [0016] 前記式（ l a)及び式（2a) で表される塩基配列は、 H S V I 型 DNA遺伝子地図上 0. 75マップユニットにある。 前 記式（ 1 a〉で表される塩基配列は BamH I Bフラグメント の 5' 末端の 31塩基上流から 12塩基上流までの補完鎖の 20塩基を含み、 前記式（2a) で表される塩基配列は Bam H I Bフラグメントの 5' 末端から 212塩基下流から 193 塩基下流までの補完鎖の 20塩基を含む。 前記式（ 1 b )及び 式（ 2b ) で表される塩基配列は、 HS VII型 DN Aの a' シ ークエンス ( J.Gen.Virol.,55,315-331,1981 )上にある。 前記式 ( 1 b ) で表される塩基配列は a' シークェンスの 5 ' 末端の 塩基下流から 28塩基下流までの補完鎖の 20塩基を含み、 前記式（ 2b ) で表される塩基配列は a' シークェンスの 5' 末端から 221塩基下流から 202塩基下流までの補完鎖の 20塩基を含む β 従って、 本発明方法において、 被検試料中に HSV I 型 DN Αが存在する場合には、 プライマー （ 1 a ) と プライマー （ 2 a〉 との組合せにより BamH Iフラグメント の遣伝子の一部に相当する 243 b p部分が、 そして被検試料 中に HS VII型 DNAが存在する場合には、 プライマー （ l b ) とプライマー （ 2 b ) の組合せにより a' シークェンスの遺伝 子の一部に相当する 213 b p部分が、 短時間の内に特異的に 大置に増幅されるので、 被検試料中における HSV I 型 DNA 及び HS VII型 DN Aの存在を極めて特異的に検出することが できる。 前記の第 1プライマー及び第 2プライマーはそれぞれ 15 me r〜3 Ome rであることができるが、 一般的には 20 me r〜25 m e rであるのが好ましい。 15me r未溝であ るとァニーリングの際の特異性が狨少し、 非特異的結合が増加 する。 また、 3 Ome rを越えるとプライマー分子間あるいは 分子内での二次構造を取り易くなるので好ましくない β 本発明 方法で用いる第 1プライマー及び第 2プライマーのそれぞれを 構成する各塩基は、 公知の任意の態様で修飾（例えば、 ビォチ ン化又は発光物質によるラベル化） されてもよい。
    [0017] 本発明による前記のそれぞれの第 1プライマー及び第 2プラ イマ一は、 通常の DNA自動合成機（たとえばアプライドバイ ォシステム社製） を用いて、 公知の DNA合成法（例えばホス ホアミダイト法） によって調製することができる。
    [0018] 本発明の DNA増幅工程（ 1 ) では、 第 1プライマー及び 第 2プライマーと共に、 DNAボリメラーゼ、 特には耐熱性 D ΝΑボリメラーゼを用いて増幅サイクルを繰り返す。 耐熱性 D ΝΑポリメラーゼとしては、 特に 95eCまでの温度で活性を維 持することのできる DNAボリメラーゼ、 例えば、 市販の Ta qボリメラーゼを用いることができる。
    [0019] 本発明の D N A増幅工程では前記の第 1プライマーと第 2プ ライマーとの特定の組合せ、 DNAポリメラーゼ及び液体被検 試料を含む混合液を用いる。 第 1プライマー、 第 2プライマー 及び DN Aポリメラーゼの使用量は、 液体被検試料の種類によ つて変化するが、 PCR法による DNA増幅工程を実行するこ とができる範囲で容易に決定することができる。 この混合液は、 場合により、 緩衝液（例えばトリス塩酸緩衝液） 、 安定化剤 (例えばゼラチン） 、 又は塩類（例えば塩化ナトリウム） を含 有することができる。
    [0020] 本発明方法では、 前記混合液を用いて PC R法の増幅サイク ルを実施する。 増幅サイクルは、
    [0021] ( i ) DNA変性工程（約 90eC〜95'Cで、 約 1 0秒間から 2分間）
    [0022] (ii) 1本鎖 DNAと第 1プライマー及び第 2プライマーとの アニーリング工程（約 37eC〜70eCT'、約 30秒〜約 3分間） 、 及び
    [0023] (iii) DNAボリメラーゼによる DNA合成工程（約 65。C〜 80eCで、 約 30秒〜約 5分間） とからなる。 1サイクル毎に D N Aは 2倍に増幅され、 nサイクル後には 2 n倍に増幅され る。 本発明においては、 前記の増幅サイクルを 1 0〜60回、 好ましくは 20〜40回繰り返す。 最後のサイクルにおいては、 工程（iii) の加熱時間を約 5〜1 0分間に延長して DNA合成 が完全に行われるようにするのが好ましい。
    [0024] 被検試料中に HSVが存在する場合には、 前記の増幅サイク ル終了後に、 約 200〜300 b pの DNAが大量に合成され る。 この DNAを次の DNA検査工程によって検出する。
    [0025] DN A検査工程としては、 ゲル電気泳動及びェチジゥムブ口 マイド染色を利用する方法、 サザンブロットハイプリッド法、 又はジデォキシ法による塩基配列決定法、 放射性標識法等を用 いることができる。 ゲル電気泳動法を行う場合には、 例えばァ ガロースゲルを担体としたサブマリーン型電気泳動、 又はァク リルアミドを用い.たスラブ型電気泳動を使用することができる。 サザンブロットハイブリッド法、 又は i n s i t iiハイブ リッド法を行う場合には、 放射性プローブ、 非放射性プローブ (例えば、 酵素標識プローブ、 ビォチン化プローブ、 ジゴキシ ゲニン化プロ一ブ又は化学発光物質、 蛍光物質で標識したプロ ーブ） を用いることができる。
    [0026] 更に、 ジデォキシ法による塩基配列決定法を利用する場合に は、 蛍光標識を使用した DN Aオートシークェンサ一（ァプラ ィドバイオシステムズ社） を用いることができる。
    [0027] 本発明は、 更に、 HSVI 型 DNA及び HS VII型 DNAの 各々の特異的な検出に用いることのできる 2種類の DN Aプロ ーブを提供するものでもある。 従って、 本発明は、 式（3) ： CCCCGATTCG GGCCCGGTCG
    [0028] CTCGCTACCG GTGCGCCACC (3) 又は式（ 4 ) ：
    [0029] CCCCGCGGGC GCCGCCCCTC CCCCCGCGCG CCGCGGGCTG (4 ) で表される塩基 S列の少なくとも 10塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有し、 標識を担持するプローブと被検試料とを接触 させ、 前記標識からの信号を検出することを特徴とする、 単純 ヘルべスゥィルスの型特異的検出方法にも鬨する。
    [0030] 式（ 3 )で表される塩基配列は、 B amH I Bフラグメント の 5' 末端から下流 50塩基から 89塩基までの 40塩基を含 む。 式（3)で表される塩基配列の少なくとも 10塩基のオリ ゴヌクレオチド部分を含有する DN Aプローブ（以下、 アロー ブ Aと称することがある） は HSVI 型 DNAの BamH I B フラグメントに特異的である。 プローブの長さは被検試料に対 する前処理の種類によって異なる。 被検試料が PC R法による DN A増幅工程を経たものである場合には、 10bp乃至 PC R法で増幅される DN A断片の大きさ （プライマー部分は除く） まで可能である。 また、 被検試料が PC R法による DN A増幅 工程を経たものでなく、 プローブ Aを i n s i t uハイプリ ンド法に用いる場合には、 プローブ Aの長さは 10bp乃至 2 87 bpの大きさまで可能である。 式（ 3〉 で表される塩基配 列の 40塩基のオリゴヌクレオチド部分からなる DN Aプロ一 ブ A (4 Ome r ) は、 被検試料が P C R法による D N A増幅 工程を経たものであっても、 あるいは i n s i t uハイプリ ッド法の場合であっても、 いずれにも用いることができるので 好ましい。 プローブ Aの調製法としては、 サクシノィミド （例 えば、 ジサクシ二ミジルスべレイト） を用いる方法、 マレイミ ド法、 活性ハロゲン法、 アジドを用いた光反応、 あるいはカル ボジィミド法を用いることができる，
    [0031] 式（4 )で表される塩基配列は、 a' シークェンスの 5' 末 端から 148塩基下流から 187塩基下流までの 40塩基を含 む。 式（4 ) で表される塩基配列の少なくとも 10塩基のオリ ゴヌクレオチド部分を含有する DNAプローブ（以下、 プロ一 ブ Bと称することがある） は、 HSVII型 DNAの a' シーク エンスに特異的である。 プローブ Bの長さは被検試料に対する 前処理の種類によって異なる。 被検試料が P C R法による D N A増幅工程を経たものである場合には、 10 乃至 01法 で増幅される DNA断片の大きさ （プライマー部分は除く） ま で可能である。 また、 被検試料が PC R法による DNA増幅ェ 程を経たものでなく、 プローブ Bを i n s i t uハイプリッ ド法に用いる場合には、 プローブ Bの長さは 1 Obp乃至 185 b pの大きさまで可能である。 配列表における配列番号 6の E列で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分 からなる DN Aプローブ B (4 Ome r ) は、 被検試料が PC R法による D N A増幅工程を経たものであつても、 あるいは i n s i t uハイプリッド法の場合であっても、 いずれにも 用いることができるので好ましい。 プローブ Bの調製法として は、 前記のプローブ Aの調製法と同じ方法を用いることができ る。
    [0032] プローブ A及びプローブ Bの標識物質としては、 従来公知の 任意の物質を使用することができる。 好ましくは、 非放射性物 質（酵素、 蛍光色素、 発光物質、 ピオチン等） を用いる。 標識 化 DNAの合成法には、 大別すると
    [0033] ( 1 ) DN Aの合成過程で直接的に標識化 DN Aを調製する方 法と
    [0034] (2) リンカ一が結合した DNAを合成してから単離し、 標識 試薬を作用させる方法
    [0035] とがあり、 特に方法（2)は目的に応じて標識の型を容易に変 更でき、 応用面で優れているので好ましい。 方法（2) で用い るリンカ一としては、 5 ' —ジメトキシトリル一 5— 〔N—
    [0036] (トリフルォロアセチルァミノへキシル） 一3—ァクリルイミ ド〕 一2' —デォキシゥリジン—3' - 〔 （2—シァノエチル） ― (N, N—ジイソプロピル〕 〕ホスホルアミダイド等を挙げ ることができる。 プローブに結合されている標識から信号を発 生させ、 更にその信号を測定する方法も、 従来から公知の任意 の方法を用いることができる。
    [0037] 本発明方法においてプライマー（ l a)及びプライマー （ 2 a) の組合せを用いると、 被検試料中に HS V I 型 DNAが存 在する場合にのみ、 B amH I Bフラグメントの遣伝子の一部 に相当する 243 b P塩基部分が短時間のうちに特異的に大量 に増幅合成される， また、 プライマー （ l b )及びプライマー (2b )の組合せを用いると、 被検試料中に HSVII型 DNA が存在する場合にのみ、 a' シークェンスの遣伝子の一部に相 当する 213 bp塩基部分が短時間のうちに特異的に大量に増 幅合成される。 従って、 被検試料中における HSV I 型ウィル ス及び Z又は HS VII型ウィルスの存在を極めて特異的に検出 することができる。 更に、 被検試料中の HSV I 型 DNA又は HS VII型 DN A量が微量であっても DNAが増幅合成される ので高感度である，
    [0038] また、 本発明においては、 （場合により増幅した） HSV I 型 D N A又は H S VII型 D N Aに特異的な標識化 D N Aプロ一 ブを用いるので、 極めて正確に HSV I 型 DNA又は HSVII 型 DNAを検出することができる。 更に、 前記の第 1及び第 2 プライマーを用いる増幅工程と前記のプローブを用いる検査ェ 程とを併用すると、 検査の所要時間はェチジゥムブ口マイド染 色の場合は 4〜 5時間程度であり、 サザンブロットハイプリッ ド法まで行う場合でも 48〜50時間程度であり、 迅速に結果 を得ることができる。 実施例
    [0039] 以下、 実施例によって本発明を更に詳細に説明するがこれら は本発明の範囲を限定するものではない。
    [0040] 実施例 1 ：プライマーの合成及びプローブの合成 381 A型自動 DN A合成装置（アプライドバイオシステム ズ社） に、 アデニン CP Gカラムを装着して、 前記式（ l a) の配列の塩基 20涸からなるプライマー（ 1 α) を合成し、 更 に、 チミン CPGカラムを装着して前記式（2 a) の配列の塩 基 20個からなるプライマー（2ひ） を合成し、 そしてグァニ ン CP Gカラムを装着して前記式（ l b)の配列に記載の塩基 20倔からなるプライマー（ 1 /3 )及び前記式（2 b ) の配列 に記載の塩基 20個からなるプライマー（2/3) をそれぞれ合 成した。 アンモニア水（約 30%) 2. 5mlを入れたディスポ シリンジ（2. 5 ml) を、 合成工程が完了した CP Gカラムに 接続し、 アンモニア水をカラム内に押し出して、 合成した DN Aフラグメントを溶出した。 回収した DNAアンモニア溶液の 入ったバイアル瓶を密栓し、 65eCで 6時間加熱した後、 室温 まで冷やしてから濃縮した。 濃縮物を凍結乾燥し、 Ι ΟιπΜト リエチルアンモニゥムアセテート （以下 TEA— Aと略す） (PH7. 4 ) に溶解し、沈殿を除いてから、 L— 6200型高 速液体クロマトグラフィー装置（日立製作所） （以下、 HPL Cと称す） に分離用カラム （YMC— Pack OD S-AM 313 ： YMC社） を装着し、 5%ァセトニトリルを含んだ 5mM— TEA— Aとァセトニトリルとによる漉度勾配を用 いて精製し、 メインピークを集めた。 得られた残渣に 80%酢 酸（ァセトニトリルで調整） を加えて懸濁させ、 室温で 30分 保持してから減圧乾燥した。 乾燥物を 1 OmM— TE A— Aに 溶解し、 ジェチルエーテルで抽出してから減圧乾燥した。 乾燥 した DNA試料を TEA— Aに溶解し、 沈殿を除いてから、 2 回目の HPLCによる精製を行い、 メインピークを集めた。 こ うして得られた精製 DNAプライマーを减圧乾燥して保存し、 後記の実施例 2及び 3で用いた。
    [0041] 前記と同様の操作により、 前記式（ 3 ) の配列に記載の塩基
    [0042] 40個からなるプローブ a及び前記式（4 ) の配列に記載の塩 基 40個からなるプローブ bを合成した。 なお、 プローブ aの 合成にはシトシン CPGカラムを用い、 そしてプローブ bの合 成にはグァニン CP Gカラムを用いた。
    [0043] 実施例 2 ：檁識プローブの調製（オリゴラベリング）
    [0044] 前記実施例 1で調製したプローブ a及び bを、 32Pによって オリゴラベリングした （フアルマシア社のオリゴラベリングキ ットを使用） 。 プローブ DNA 10 Ongを含む水溶液 4〃1に水
    [0045] 58〃1を加えて、 10分間100 で加熱後、直ちに氷冷した。 氷冷したプローブ液にデォキシヌクレオチド三焼酸混液 2 OuU ゥシ血清アルブミン 4 /Ι、 クレノウ酵素 4〃1、 α—32 Ρ— d CTP ( 30 OC i ) を加え、 室溫で 2時間保持した。 次 に、 反応停止液 4 O M キャリア UNA ( 1 Omg/ml)
    [0046] 4 及び水 36 OjLdを加えて希釈した反応液に、 4Μ塩化 ナトリウム 0. 1容量部、 エチルアルコール 2容量部を加え、 一 7 CTCで 1 5分間放置して DNAを沈殿させ、 1 5 , 000 回転で遠心した。 得られた沈殿を、 lmM— EDTAを含む 1 OmMトリス塩酸緩衝液 30 1に溶かし、 7. 5Mアンモニ ゥムアセテート 1 6〃1及びエチルアルコール 92〃1を加え、 — 7 CTCで 1 5分間放置した後、 遠心した。 得られた沈殿に 7 5%エチルアルコール 2 0 Ο (1を加えて更に遠心し、 得られ た沈殿を室温で 2時間風乾した。 得られた標識プローブを、 1 mM— EDTAを含む 1 OmMトリス塩酸緩衝液 200〃1に溶 かした。 こうして得られた標識プローブ溶液は、 1回のドット ブロッテイングに対して約 10〃1の量で用いる。
    [0047] 実施例 3 ：標識プローブの調製（ヱンドラべリング）
    [0048] 32 pでエンドラベリングしたプローブの調製は以下の方法で 実旃した。 前記実施例 1で調製したプローブ DNA500ngを 含む溶液 1〃1に、 10Xキナーゼ緩衝液 2. 5 T4ポリ ヌクレオチドキナーゼ 1. 5 1 ( 15単位）及びァ -32P- d ATP 2 ( 20 OC i ) を加え、 37eCで 45分間保持し た。 次に、 メチルアルコール 2ml及び洗浄液（ 0. 1Mトリス 一 HC 1の 100ml中にトリェチルァミン 14 を含む 1 mM— EDTA— 1Mトリス塩酸緩衝液： pH7. 7 ：以下 A液 と称する） 2πύで洗った逆相イオン交換カラム （NEN SO RB20カラム： DuPont社） に、 A液 40 を加えた 前記反応液を流した。 続いて、 前記カラムを A液 3 ml及び水 3 mlで洗浄した後、 20 %エチルアルコール水溶液 1 mlで標識プ ローブを溶出した。 標識プローブは最初の 50 の画分に溶 出された。 一回のハイブリダィゼイシヨンには、 溶出液 50 1 を用いる。
    [0049] 実旌例 4 ： HSVの DNAの抽出
    [0050] HSV I型の標準株とし WT51— 3— 4 [角膜ヘルぺス患 者からの分離株： ActaVirol.23:226-230(1979)] を、 そして H S VII型の標準株として UW268を用い、 更に型が判明してい る HSV野性株として臨床分離株（HSV感染患者のへルぺス 様部位から単離） を I型及び II型のそれぞれについて 5株ずつ 用いた。
    [0051] 各ウィルスをアフリカミドリザルの腎由来の CV— 1細胞に 1 P f uZ細胞の瀵度で感染させた。 ウィルスに感染した細胞 を 5%二酸化炭素一 95%空気の気相中で培養した。 細胞変性 効果の見られた細胞を用いて、 庶糖法 （Virology, 93,260-264, 1979) によりウィルス DNAを抽出した。
    [0052] 実施例 5 ： PCR法による HSV— DNAの増幅
    [0053] 前記実施例 4で抽出した H S V I型標準株の D N A及び型既 知の HSV野性株の DNA各 1 Ongを、 125 M— dATP、
    [0054] - dCTP、 125 一 dTTP、 31. 25 ίΜ-dGTP, 93. 75〃Mデァザ C7 GTP (以下 dC7 dGTPと略す） 、 0. 01%ゼラチン、 2 Om トリス塩酸 緩衝液（ρΗ8· 8) , 1. 5mM— MgC l 2、 5 OmM— KC 1、 10%ジメチルスルホキシド、 プライマー及び 2. 5単位の Ta qボリメラーゼ（ Amp 1 i Ta q DNA ボリメラーゼ： シータス社） を含む PC R反応液 100 1に加 えた。 HS VI型用プライマーを用いた系での PCR法は（ i ) 92eCで 1分間、 （ii) 60eCで 1分間、 及び（iii) 72。Cで 2分間からなるサイクルを 30サイクル実施し、 最後に 72 C で 5分間のプログラムで DNAの増幅を行った。 H S VII型用 プライマーを用いる系での PC Rは （ i ) 93eCで 1分閭、 (ϋ) 65eCで 1分閭、 及び（Hi) 73eCで 1分間からなるサ ィクルを 30サイクル行った後、 最後に 73eCで 5分間のプロ グラムで DN Aの増幅を行った。
    [0055] 実施例 6 ：電気泳動による PCR反応生成物の確認と診断
    [0056] 電気泳動用のゲルは、 トリス塩酸 5. 4 gと硼酸 2. 75 g と 0. 5M— EDTA2mlとを含む緩衝液（ρΗ8· 0 ) (以下 0. 5ΧΤΒΕと略す） 1リットルにァガロースゲル 4%を溶 解し、 ムビド （アドバンス社〉のゲルプレートに流して調製し た。 次に、 PCR反応後の溶液 1 Ο ΙΙにフイコールタイプ 400 (フアルマシア社）の 15%水溶液 2 Atlを混合し、 その 混合物全量をサンプルゥエルに入れた。 1 XTBEを電極槽に 入れて、 室温で 100Vにて 2時間電気泳動を行った。 電気泳 動終了後に、 ァガロースゲルをェチジゥムブ口マイドで染色し、 U Vイルミネイタ一照射下で電気泳動の結果を確認した。 H S V I型用プライマーを用いた結果を第 1図に、 そして H S VII 型用プライマーを用いた結果を第 2図に示す。 第 1図及び第 2 図において記号は以下の意味である。
    [0057] M： DNAマーカー、
    [0058] 1 ： HSV I型標準株（WT51 -3-4 ) 、
    [0059] 2〜6 ： HSV I型野性株、
    [0060] 7 ： HS VII型標準株（ UW268 ) 、
    [0061] 8-12 ： HS VII型野性株、
    [0062] なお、 DNAマーカー（φΧ174— Ha elll d i e s t ) としては、 下から 72bp、 118bp、 194bp、 234 bp、 271 bp、 281 bp. 310bp、 603bp、 872bp、 1078b p、 及び 1357 b pと現われるもの を用いた。第 1図及び第 2図から明らかなように、 本発明によ るプライマーを用いて PCR法を行なうことによって、 目的と する H S Vの型特異的な D N A特定部位の増幅が可能となる。 なお、 第 2図のェチジゥムブ口マイド染色によれば、 HSVI型用プライマーを用いた PCR法において、 HSV I型及び HS VII型のそれぞれに複数のバンドが観察される。 HSV I び HSVII型では、 それぞれ増幅される部分が異なるので、 それぞれの標準株との対比から H S V I型及び H S VII型の判 定は可能であるが、 この点を更に確認するために、 実施例 3で 調製したエンドラベリング檩識プローブ a及び bを用い、 サザ ンハイブリダィゼイシヨンを行なった e 即ち、 電気泳動後のァ ガロースゲルから DN A Hyb r i d i z at i o n memb e r ane (Ge ne Sc r e e nP l u s ： Du P o n t社） にサザンブロットしたものと各々のプローブをハ イブリダィゼイシヨンした後、 オートラジォダラフィ一を得た β 結果を第 3図に示す。 第 3図のレーン 1及びレーン 3は HSV I型檩準株（WT 51— 3— 4 )であり、 レーン 2及びレーン 4は HS VII型標準株（UW268) である。 更に、 第 3図の レーン 1及びレーン 2にはエンドラベリング標識プローブ aを 使用し、 レーン 3及びレーン 4にはエンドラベリング標識プロ ーブ bを使用した， 第 3図から明らかな様に、 HS VII型用プ ライマーをテンプレートにして増幅したバンドだけが HS VII 型判別プローブ bとハイブリダィズし、 HSV I型用プライマ 一をテンプレートにして増幅したバンドは H S VII型判別プロ ーブ bとハイブリダィズしなかった。 以上の結果から明らかな ように、 本発明のプライマーで患者検体の DN Aを増幅し、 増 幅された D N Aを本発明のプローブで確認することにより H S V感染症の起因ウィルスが HSV I型であるのか、 あるいは H S VII型であるのかの型確定診断を行なうことができる。
    [0063] 実施例 7 ：水泡内容液のドットブロット法による HSVの型判 M
    [0064] ヘルぺス感染症の疑いのある患者から採取した水泡内溶液 5 Λίΐを生理食塩水 2mlに懸濁して、 希釈した。 希釈検体 200 1に同容量の 0. 5N— NaOHを加ぇ、 室温で 10分間放置 した。 DNAを変性させた前記の処理済検体 5 を Ge n e Sc re e nP l u sNEF976 (DuPont社） を装着したブ ロッテイング装置に載せ、 室温で 30分間放置した後、 吸引に より液を除いた。 DNAをブロットした Ge n e S c r e e n P 1 u sNEF976をプラスチック袋に入れ、 続いて、 0. 2%ポリビニルピロリドン（分子量 40， 000 ) 、
    [0065] 0. 2%フイコール（分子量 40, 000) 、 0. 2%ゥシ血 清アルブミン、 0. 05Mトリス塩酸緩衝液（pH7. 5 ) 、 1 M塩化ナトリウム、 0. 1%燐酸ナトリウム、 1%ラウリル硫 酸ナトリウム、 10%デキストラン硫酸ナトリウム （分子置 500, 000 ) 、 及び変性した娃精子 DN A ( 100 g/ ml) の組成からなるハイブリダィゼイシヨン液 5mlを加えて密 封した。 65 で 6時間放置した後、 実施例 2で調製した32 P で標識（オリゴラベリング） した HSV型判別用プローブを加 え、 更に、 65'Cで 6時間放置した。 処理の終わった Ge n e S c r e e n P 1 u s NEF 976を、 大量の 0. 3M塩化ナ トリウムと 0. 034Mクェン酸三ナトリウムを含む 2XSS C (pH7， 0) 中で、 室温下及び攙拌下に 5分間、 2回洗浄し た後、 2XSSC、 1%SDS中で 65eCにて 15分間で 2回 洗浄した後、 更に、 室温下及び攙拌下に 5分間、 0. 1 XSS C中で 2回洗浄した。 洗浄後の膜を室温で 1時間風乾した。
    [0066] H S Vの型判別用プローブとのハイプリダイゼィション処理 の終わった G e ne Sc r e e nP l u sNEF976を感光 用カセットに入れて固定し、 フィルム （Ko dak— X— OM AT-AR XAR5 ) に重ね、 — 70eCで感光させ、 現像し た， 結果を第 4図に示す。 第 4図において、 1〜5は患者検体 であり、 6は HSV I型標準株であり、 7は HS VII型標準株 であり、 図面右側の記載は判定結果である. 第 4図から明らか なように、 プローブ aは HSV I型のウィルスと、 プローブ b は HS VII型のウィルスとハイブリダィズしている，
    [0067] 実施例 8 ：水痛内溶液 HSVの型判別
    [0068] ( 1 )実施例 7で用いた水泡内溶液 5 1を生理食塩水 2mlに 懸濁した， 希釈検体 50 1に 6Mグァニジンイソシァネート
    [0069] 50 1とガラスパウダー 1 Ojulとを加えて室温で放置した。
    [0070] 10分後、 1 5 , 000回転で 2分間遠心し、 上清を捨てた。 沈殿に 50%エチルアルコール、 1^ー£0丁八及び5 OmM 塩化ナトリウムを含む 1 OmMトリス塩酸緩衝液（pH7. 4 ) lmlを加えて懸濁し、 攪拌後、 1 5 , 000回転で更に 2分間 遠心した， 遠心によるガラスパウダーの洗浄を 3回繰り返した。 洗浄したガラスパウダーに蒸留水を 50 Atl加えて懸濁させ、
    [0071] 55 で 1 5分間放置した， 次に、 1 5， 000回転で 2分間 遠心し、 その上清を DNA抽出液として PCR法による DNA の増幅工程に用いた， 前記実施例 5に記載の方法によつて D N A増幅工程を行ない、 実施例 6に記載の方法によって P C R反 応生成物の型判定を行なった。
    [0072] ( 2 )一方、 対照試験として、 従来の蛍光抗体法を実施した。 即ち、 病変部位を細い綿棒で擦り取り、 無蛍光スライドの 2ケ 所に塗沫し、 自然乾燥させてから、 室温で 10分間アセトン固 定を行なった。 次に、 それぞれの固定された検体を、 蛍光標識 した抗 HSV I型抗体（ S y V a社） 又は抗 H S VII型抗体
    [0073] ( Sy V a社） と室温で約 30分間反応させた。 スライドガラ スを水洗し、 グリセリン包埋した後、 これを蛍光顕微鏡下で観 察した。
    [0074] ( 3 )更に、 対照試験として、 従来の臨床診断法（医師が発病 部位や病巣を観察して診断する） を実施した β これらの結果を 第 1表に示す。 第 1表
    [0075] 検査方法 HSV- I HSV-II 検香不能 判定不能
    [0076] PC I法 2 6 0 0 蛍光抗体法 7 1 8 2
    [0077] 3 3 2 第 1表に示すように、 供試した水疱内溶液 18検体中、 臨床 診断法では HS VI型 3検体、 HS VII型 3検体、 そして判定 不能（ I型であるか II型であるのかを確定的に診断できないも の） 12検体であり、 蛍光抗体法では HS VI型 7検体、 HS VII型 1検体、 検査不能（患部細胞を採取できない） 8検体、 そして判定不能 2検体となった。 これに対し、 本発明によるド ットブロットハイブリダィゼイシヨンの DN A検査では、 HS 1型12検体、 そして HSVII型 6検体となり、 検査不能及 び型判別不能の検体はなかった。
    [0078] 実施例 9 ：咽頭拭い液の HSVの型判別
    [0079] 実施例 8 ( 1 ) に記載の方法により、 ヘルぺス感染症の疑い のある患者の咽頭拭い液から DN Aを抽出した。 この抽出 DN Aを用いて、 実施例 7に記載のドットブロット法による HSV の型判別と実施例 8 ( 1 ) に記載の PCR法による HSVの型 判別を行った。 咽頭拭い液 36検体中、 ドットプロット法では HSV I型 10検体、 型判別不能 10検体、 そして陰性 16検 体の結果が得られたが、 本発明による PCR法では HSV I型 が 32検体で残り 4検体が陰性と言う高い型判別能を示した。 これらの結果を第 2表に示す β 第 2表
    [0080] 検査方法 _総検体数 HSV-I HSV-II 判定不能 陰性 ドットフ'ロット法 36 10 0 10 16
    [0081] PCRg_ 36 32 0 0 4 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自 明の変形や修正は本発明の範囲に含まれる . 産業上の利用分野
    [0082] 本発明方法は、 HSV I型 DNA又は HSVII型 DNAに特 異的な DN A断片の増幅に用いることのできる各種プライマー、 及び H S V I型 D N A又は H S VII型 D N Aに特異的なプロ一 ブとして、 化学合成が可能な程度の大きさで、 しかも型別の特 異性が減少しない塩基配列からなるォリゴヌクレオチドを提供 するものである， 従って、 HSV I型又は HSVII型の感染症 を高精度で、 迅速に、 しかも型特異的に識別することができ、 その結果を診断及び治療に役立てることができる。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    1. 式（ l a) ：
    CACGGGTATA AGGACATCCA ( l a) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有する第 1の DNAプライマーと、 式（ 2 a ) ： GGGTCCTCGT CCAGATCGCT (2a) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有する第 2の DNAプライマーとの組み合わせ、 あ るいは式（ l b ) ：
    GCCTCTTTTC CCCCGGGGAG (l b) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォリゴヌクレオチ ド部分を含有する第 1の DNAプライマーと、 式（2b ) ：
    GGGAAAAAAG CCGCGCCGGGG (2b ) 表される塩基配列の少なくとも 15塩碁のォリゴヌクレオチド 部分を含有する第 2の DNAプライマーとの組み合わせと、 D NAボリメラーゼと、 水性液体被検試料とを含む混合液を DN A增幅工程にかけ、 続いて、 得られた反応液を DN A検査工程 にかけること特徴とする、 単純へルぺスゥィルスの型特異的検 出方法。
    2. 式（ 1 a) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有する第 1の D N Aプライマーと、 式（2a)で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のオリゴ ヌクレオチド部分を含有する第 2の DN Aプライマーとの組み 合わせを用い、 単純へルぺスウィルス I型を型特異的に検出す る請求項 1記載の方法。
    3. 式（ 1 a ) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有する第 1の D N Aプラィマーが
    2 Ome r〜25 m e rである請求項 1又は請求項 2に記載の 方法。
    4. 式（ 2 a〉 で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有する第 2の D N Aプライマーが
    2 Ome r〜25 m e rである請求項 1又は請求項 2に記載の 方法。
    5. 式（ 1 b ) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有する第 1の DN Aプライマーと、 式（ 2b )表される塩基配列の少なくとも 15塩基のオリゴヌ クレオチド部分を含有する第 2の DN Aプライマーとの組み合 わせを用い、 単純へルぺスウィルス II型を型特異的に検出する 請求項 1記載の方法，
    6. 式（ 1 b ) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有する第 1の D N Aプライマーが
    2 Ome r〜25me rである請求項 1又は請求項 5に記載の 方法，
    7. 式 （ 2 b ) で表される塩基配列の少なくとも 15塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有する第 2の DN Aプライマーが
    2 Ome r〜25 m e rである請求項 1又は請求項 5に記載の 方法。
    8. DN A増幅サイクルが
    ( i ) DNA変性工程（約 90eC〜95eCで、 約 10秒間から 2分間）
    (ii) 1本鎮 DNAと第 1プライマー及び第 2プライマーとの アニーリング工程（約37で〜70 で、約 30秒〜約 3分間） 及び
    (iii) DNAポリメラーゼによる DNA合成工程（約 65eC〜 8CTCで、 約 30秒〜約 5分間） とからなる、 請求項 1〜7の いずれか一項に記載の方法。
    9. DN A検査工程が、 ゲル電気泳動法、 ェチジゥムブ口マイ ド染色法、 サザンブロットハイブリッド法、 i n s i t uノヽ イブリッド法、 ジデォキシ法による塩基配列決定法又は放射性 標識法である、 請求項 1〜7のいずれか一項に記載の方法。
    10. 式（3 ) ：
    CCCCGATTCG GGCCCGGTCG CTCGCTACCG GTGCGCCACC (3 ) 又は式（ 4 ) ：
    CCCCGCGGGC GCCGCCCCTC CCCCCGCGCG CCGCGGGCTG ( 4 ) で表される塩基配列の少なくとも 10塩基のオリゴヌクレオチ ド部分を含有し、 標識を担持するプローブと被検試料とを接触 させ、 前記標識からの信号を検出することを特徴とする、 単純 ヘルべスゥィルスの型特異的検出方法。
    1 1. 式（ 3 )で表される塩基配列の少なくとも 10塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有するプローブを用い、 単純ヘルべ スウィルス I型を型特異的に検出する、 請求項 10記載の方法。
    12. 式（4 ) で表される塩基配列の少なくとも 10塩基のォ リゴヌクレオチド部分を含有するァローブを用い、 単純へルぺ スウィルス II型を型特異的に検出する、 請求項 10記載の方法。
    13 - DN A検査工程に、 式（3 )又は式（4 ) で表される塩 基配列の少なくとも 10塩基のォリゴヌクレオチド部分を含有 するプローブを用いる請求項 1記載の方法。
    14. DN A検査工程に、 式（ 3〉 で表される塩基配列の少な くとも 10塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有するプローブ を用いる請求項 2記載の方法，
    15. DN A検査工程に、 式（4 )で表される塩基配列の少な くとも 10塩基のオリゴヌクレオチド部分を含有するプローブ を用いる請求項 5記載の方法。
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